您当前所在位置:亚急性心肌梗死 > 病因发现 > 心脏缺氧干细胞小生境缺氧微环境在心脏

心脏缺氧干细胞小生境缺氧微环境在心脏

《心血管领域新进展》连载

作者

KimuraWataru1,SadekHeshamA.1

1DepartmentofInternalMedicine,DivisionofCardiology,UTSouthwesternMedicalCenter,Dallas,TX,USA

译者

王鹏，山东大学医学院

审校

薛澄，医院

Hifs与缺氧反应

对于需氧生物，其细胞需要氧气（O2）供给才能通过氧化磷酸化产生细胞内ATP。O2的可利用性在很大程度上影响了几乎所有的生物学过程，因此，缺氧反应对于所有生物均有重要意义。在缺氧过程中，细胞激活了许多适应性生理反应，而这些反应又直接影响了能量代谢，氧化还原平衡，血管重塑等多个方面。无论在细胞水平还是器官水平，缺氧都能引起相应转录水平的提高从而来抵消O2不足，而Hifs是这些转录程序的关键调节因素（1）。Hifs是由一个受O2调节的α亚基和一个存在异构体的β亚基组成的异质二聚体；而在哺乳动物中，人们已经发现了3种Hifs异构体。Hif-1α和Hif-2α在氨基酸结构方面高度相关，而且其分子及生物学作用已经得到了很好的阐述。Hif-1α在机体内分布广泛，而Hif-2α和Hif-3α仅在相应组织选择性表达，如血管内皮细胞（2）和肾小管周围的间质细胞（3）。Hif-1α表达可促使细胞从氧气依赖的氧化代谢方式转变为胞质内无氧糖酵解代谢方式，同时，研究发现Hif-2α是氧化应激反应的主要调节因子（4）。人们对于Hif-3α的认识有待进一步提高，但已发现Hif-3α存在大量经不同剪切而成的异构体，其中的一部分是Hif-1α和Hif-2α的显性负性突变体（5-10）。

氧分压引起的Hifα活性变化已在转录，翻译及翻译后水平三个方面得到了证实。Hifα蛋白质稳定性有赖于O2调节——这也是一个经典的且已得到证实的机制（图1A）。在正常的氧分压，或含氧量正常的条件下，Hifα亚基在氧依赖性降解（ODD）结构域的保守脯氨酸残基处发生羟基化（9）。这种结构改变由3种酶（PHD1-3）介导，这些酶都含有脯氨酸羟化酶结构域，而且酶活性需要O2调节（9）。具有羟基化脯氨酸残基的Hifα亚基在泛素连接酶E3，逢希伯—林道复合体识别后，经泛素介导的蛋白酶旁路降解。而在缺氧条件下，Hifα脯氨酸羟基化因羟基化底物O2缺乏而受到抑制，从而维持Hifα蛋白质的稳定性。

图1.O2依赖型HIF调节途径。（A）一条已得到证实的O2调节HIF活性的经典机制。在正常的氧环境中，HIFα在含有脯氨酰羟化酶结构域的酶类（PHDs）作用下发生羟化，然后经E3泛素连接酶逢西伯—林道（VHL）识别，发生蛋白酶介导下的降解。在缺氧环境下，HIFα较为稳定，并且通过与缺氧反应元件（HRE）结合来激活下游众多的靶基因；（B）激活或抑制HIF的因子。需要指出的是这些因子可以在多个层面调节HIF活性。如Meis1可以调节HIF的转录，而RSUME和SEMP1可以调节HIF蛋白质水平的SUMO化。

在最近的研究中，有关Hif蛋白质调节因子的报道越来越多，诸如具有天冬氨酰羟化酶活性的Hif-1α抑制因子（FIH1）、组蛋白去乙酰化酶、一些原癌基因、肿瘤抑制因子，也包括大量的转录调节因子［由Majmundar等（11）和Semenza（12）检验］。以上研究成果表明，Hif复合物在多种细胞生化背景中都有更为复杂以及精密的调节机制（图1B）。

在缺氧条件下，结构稳定的Hifα与Hifβ形成异质二聚体，这样同时造成了Hifα构象变化，该变化促使Hif异质二聚体可结合于全基因组的缺氧反应元件（HREs）（13），并进一步促使上百种目标基因的转录（14,15）——具体目标基因包括促红细胞生成素（16,17），血管内皮生长因子受体（18,19），二者分别促进了造血和血管新生。Hif复合体对激活糖酵解的基因具有调节作用，包括葡萄糖转运体（如GLUT-1）糖酵解调节酶如6-磷酸-2激酶/果糖2，6二磷酸酶（PFKFB1-4），己糖激酶II（HKII）和乳酸脱氢酶A（LDHA），在另一方面，Hif复合体也抑制线粒体氧化代谢，包括丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）［由Iyer等（20），Bartrons和Caro（21），以及WheatonandChandel（22）检验］。这些研究结果组成的网络阐明了由线粒体磷酸化到糖酵解的转变过程。Hif复合体介导的转录过程可以调节许多生物学过程，包括胚胎发育、肿瘤进展以及本文着重提及的干细胞生物学特质——如干细胞数量的维持，自我修复及分化。

成体干细胞内的缺氧信号

造血干细胞（HSCs）不但可以自我更新，而且具有多系分化能力，其在机体的整个生命周期中维持并补充全血细胞数量（23,24）。容纳HSCs的微环境，即小生境，为HSCs的储存，增殖及分化提供了足够的调节信号。而低氧分压即为HSCs微环境的标志物之一，因此我们也称这种微环境为“缺氧微环境”（25）。大量的研究指出这种缺氧环境是维持HSCs静止期所必需的。而且，低氧分压培养出的骨髓细胞的集落形成能力和移植能力会提高（26-28）。因此，不仅HSCs能够接受低氧环境，而且HSCs的功能维持需要低氧环境（26,29,30）。包括我们团队在内的很多研究机构最近都报道称：LT-HSCs的Hif1α在mRNA及蛋白质水平都有所升高，而且Hif1α在维持HSCs静止期及HSCs抗压能力方面有着十分重要的作用（31-33）。

因为HSCs在体内存活时间长，所以HSCs必需有相应的机制来抵抗及消除包括氧化压力在内的各种压力因素。我们团队的研究显示在能量供给上，LT-HSCs通过胞质内糖酵解来替代线粒体内的有氧呼吸作用（32），因此，减少了线粒体来源的活性氧（ROS）成分。我们发现特异性敲除HSC的Hif1α导致线粒体呼吸增强及糖酵解量降低（33）。有趣的是HSC细胞似乎可以在多个层面调节Hif1α。近期我们发现同源结构域转录因子Meis1可以激活Hif1α转录，从而发挥在维持HSC数量方面的重要作用（32,33）（图2）。Meis1也调节Hif2α转录，而Meis1缺失可以导致Hif2α水平下调及ROS水平上调。另一个有趣的结果是，全身应用ROS清除剂可以缓解Meis1缺失型个体在HSC方面的症状。以上结果有力的支持了我们的理论——即缺氧信号及氧化应激调节在HSC数量维持和存活方面的核心作用（32,33）。

图2.在LT—HCSs中，Meis1及其辅因子可以上调HIF-1α和HIF-2α表达。这种转录水平的激活作用对于维持糖代谢表型及阻止ROS介导的细胞衰老和凋亡有重要的作用。

除造血系统外，低氧与Hif基因的组合在其他成体干细胞群中也有重要作用。脑部海马室下区，即神经干细胞（NSC）微环境，具有与HSC低氧微环境相同的氧分压（34），而且Hif1α减少了NSC增殖，分化及神经成熟（34）。更重要的是，在一些肿瘤干细胞中，Hifs水平上调且对于细胞存活及分化有重要作用［由Semenza（12），Kobayashi和Suda（35），Heddleston等（36）以及Li和Rich（37）检验］。例如，胶质瘤干细胞表达Hif1α和Hif2α，而且在肿瘤细胞的自我修复及致肿瘤能力方面有重要作用（38,39）。另外，Hif1α抑制剂棘霉素通过消除肿瘤干细胞的方式，根治淋巴瘤及急性髓性白血病（40）。因此，缺氧及Hif1α上调似乎是多种干细胞共有的特征，也可能是调节干细胞特性的重要因素之一。

组织特异性心脏祖细胞

长久以来，研究者认为在成年哺乳动物心脏中不会出现心肌细胞转化，因为心肌损伤一定会造成不可逆的疤痕形成（41-43）。但是，新的研究证据显示成年哺乳动物心脏在正常老化（44-48）和疾病（45,46,48-50）过程中确实存在一定的心肌细胞修复。但是，这种程度的心肌细胞修复在损伤后收缩功能恢复方面是远远不够的。在另一反面，某些鱼类（51,52）两栖类（53-56），胎儿（57）和新生哺乳动物（58）有很强的再生能力来修复心肌组织损伤，而且其修复细胞来源为现有心肌细胞（58-61）。有趣的是，近期研究显示成年哺乳动物心脏可以从未知来源的干细胞或祖细胞处获得少量的心肌细胞（62）。

一些研究指出成年啮齿类和人类心肌中存有干细胞/祖细胞群，而且该群细胞似乎在体外实验中有转化为心肌细胞的潜在能力（63-65）。此类细胞群成为心脏修复方面引起研究注意力的细胞来源，因此，在过去的几十年中，人们开展了许多研究来检验该细胞群在心脏再生中的作用[由Laflamme和Murry（49）、Hansson等（66），以及Choi和Poss（67）]。在小鼠体内实验中，人们已经证明：表达干细胞受体c-kit（68），干细胞抗原-1[Sca-1，（69）]，胰岛转录因子-1[Isl-1，（70）]的细胞群，以及侧群细胞（SP）群（71）可以作为心脏驻留性祖细胞，因为这些细胞群具有分化为心肌细胞系的能力。而且，研究者已经证实在新生儿心脏中的祖细胞表达c-kit，Sca-1，Isl-1（72-77），或报道称其具有SP细胞特征（78）。尽管SP细胞，C-kit+细胞，Sca-1+细胞和Isl1+细胞都具有分化为平滑肌细胞，内皮细胞和心肌细胞的能力，但是从另一方面来看，他们确实是已分化的细胞群。例如，Isl1+祖细胞并不表达c-kit，这点与SP细胞、C-kit+细胞、SCa-1+细胞不同[由Guan和Hasenfuss（79）、Bollini等（80）检验]。另外，他们于心脏内分布似乎是不同的——SP细胞，Sca-1+细胞和c-kit+细胞主要分布于心房（73,74），Isl1+细胞在心室及心房内都有广泛分布（70）。因此，有必要研究在心脏稳态，老化及损伤后，这些细胞系中究竟是哪系促进了心脏再生。然而，限定有关基因的细胞发育制图研究仍在起步中，而此研究可最终确定“能够称作心脏干细胞或祖细胞”的细胞系。

心外膜或可作为心脏祖细胞的来源

基于解剖定位与心外膜标志物的表达，研究者又确定了另一个心脏驻留祖细胞。在斑马鱼模型中，研究者观察到在心脏损伤后1至2天内心外膜被激活（60,81,82），在这个过程中，心外膜细胞增殖，表达胚胎期心外膜基因，并进行上皮—间质转化（82-84）。类似的情况在成年哺乳动物心脏上亦可观察到——心肌梗死或胸腺肽β4刺激激活心外膜（85），以上过程亦伴有增殖，表达胚胎期心外膜基因（86），及旁分泌相关因子来减轻心肌损伤反应（83,87-90）。

在过去的几年中，越来越多的证据显示在机体正常发育及损伤后的过程中，心外膜中也存在已分化的祖细胞（91,92）。研究者通过谱系跟踪WT1-Cre（93）及Tbx18-Cre（94）发现胚胎过程中，心外膜来源的细胞可分化为成纤维细胞，血管平滑肌细胞及心肌细胞。[但是在心外膜起源的心肌细胞方面，人们依然存在争议，这是因为有研究称Tb×18并不仅仅在心外膜表达，在发育中的心肌细胞也有表达（95）]更重要的是，Chong等人研究显示成年人心外膜含有多能干细胞群，该细胞群具有分化为心肌细胞，血管内皮及平滑肌的能力（96）。而且，在心脏损伤后上调成年人心脏心外膜WT1水平后，Zhou等人使用谱系追踪的结果显示：心外膜来源的细胞群可分化为成纤维细胞及血管周围平滑肌细胞，并未分化为心肌细胞（83），但是该细胞群在胸腺肽β4预处理后可分化为心肌细胞（85）。该研究证明了心外膜细胞群作为心脏祖细胞的作用，虽然尚缺乏相关的细胞发育制图研究——即明确指出心外膜细胞是心肌细胞转化的主要来源。

低氧心脏祖细胞

上文提到的研究证实了心外膜是心脏祖细胞的潜在来源，但依然有两点尚不清楚——心外膜是否为真正的心脏祖细胞/干细胞的微环境，在成年人组织中心外膜是否也像其他干细胞微环境一样具有缺氧属性。为了回答这个问题，我们在最近的研究中尝试在未损伤的成年哺乳动物心脏中寻找低氧区域，而且我们发现心外膜及心外膜下心肌区域为心脏低氧微环境（97）。在整个心室范围内，心外膜及心外膜下心肌（心外膜下三细胞层内）区域的毛细血管密度最低，其中超过50%心外膜细胞，不到10%的心外膜下心肌细胞表达Hif1α蛋白质。此外，我们在此区域分离出非心肌细胞并于体外进行细胞培养，发现这些细胞为同克隆源性，具有自我修复能力，并表达心脏祖细胞和心外膜标志，更重要的是，具有分化为其他细胞系的能力，包括内皮细胞，平滑肌细胞及心肌细胞。该研究结果证明了心外膜及心外膜下心肌区域即为成人心脏缺氧微环境，并同其他成人组织的缺氧微环境相似的含有一定数量的祖细胞（图3）。

图3.心外膜及心外膜下心肌处的心脏缺氧微环境。这种微环境为不同代谢分化方向的糖酵解祖细胞（GPCs）提供了发育环境。分离出的心外膜GPCs线粒体含量低，并且表达c-kit-;Sca-1-;Nk×2.5+特征，同时其在体外可以分化为内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞。

为了证明代谢表型与祖细胞/干细胞表型之间的联系，我们发现这些低氧微环境的细胞代谢主要依靠胞质内糖酵解，而不是线粒体氧化磷酸化（正是因此，我们将此类细胞命名为糖酵解型心脏祖细胞或GCPs）。同时正如我们所预料的那样，敲除该细胞群Hif1α基因导致代谢由糖酵解转变为线粒体氧化磷酸化，而且该过程与细胞增殖，细胞自动分化相关联。这些结果都显示在心外膜低氧微环境内，Hif1α通过调节糖酵解表型可维持祖细胞/干细胞数量，而且是其中的重要因素——这点与LT-HSCs相似（97）。

在低氧心脏祖细胞方面，仍然有很多问题亟需解决。例如，在正常老化过程及心肌损伤后，该细胞群确实促进了心肌细胞转化吗？为彻底回答这个问题，我们需要进行细胞发育制图研究。但是对于GCPs的谱系追踪目前技术上尚不可行，同时，我们并未发现GCPs或心脏低氧微环境细胞的特异性标志物。另外，GCPs在体内的增殖，迁移和分化的过程，与低氧反应（例如两者谁先出现于心肌梗死后）之间的关系亟需回答。先已证实高ROS水平可以促使其他干细胞（如HSCs）脱离静止期，自发性分化，并失去了自我更新能力（98-）。心肌ROS水平在急性心肌梗死后（,）及缺血/再灌注（-）及慢性心脏衰竭（-）显著提高，上述过程中ROS在调节心肌细胞损伤和死亡方面发挥主要作用（-）。考虑到HSCs与GCPs之间的相似性，我们有必要确定体内ROS富集环境如何影响GCPs，并证实其是否在ROS损害心肌方面亦有作用。另一个重要的问题是心外膜/心外膜下心肌细胞向心肌损伤处迁移的潜在机制是什么。现阶段认为心外膜/心外膜下心肌细胞可以迁移到心肌壁并分化为心肌细胞（85），但是控制其迁移的因素尚不清楚。一个可能机制是因损伤引起而出现的低氧本身（,）。现已证实低氧可促进干细胞募集，例如HSCs经Hif1α调节而产生的趋化因子SDF-1/CXCL12途径——经此途径，HSCs归巢进入低氧骨髓微环境[由Shiozawa等（）、Kavanagh和Kalia（）、Suárez-álvarez等（）以及Schulz等检验（）]。包括SDF-1在内的趋化因子在急性心肌梗死后上调并募集各种祖细胞群，这些过程都具有心脏保护作用（,）。而且，有报道称在斑马鱼中SDF-1/CXCL12在心脏损伤后可调节心肌细胞迁移（）。因此，心肌损伤后，低氧或许具有双重作用，即维持心外膜细胞数量及募集心外膜细胞。但是，我们仍缺乏对于影响心外膜归巢和迁移的机制的全面理解。

结语

可以看出，成年哺乳动物心脏中是否存在心脏干细胞是一个已经凸显的问题。虽然诸如造血系统等的成年个体组织中确实含有符合要求的干细胞，但是这点是否适用于心脏尚不清楚，尤其是在发育过程中能否找到心脏细胞来源也未可知。从分化角度来看，一个严格意义上的干细胞必须在心脏中具有分化为全细胞系的能力，不仅仅包括心肌细胞，还应有成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等，而这些细胞的发育过程是截然不同的。在胚胎期的心脏形成过程中，心脏祖细胞主要由两个位于内脏中胚层的细胞来源提供——其中一个是内胚层的心脏区域，另一个是前心外膜[由Dyer和Kirby（）、Abu-Issa和Kirby（）、Lie-Venema等（）以及Ishii等检验（）]。内胚层心脏区域细胞主要可分化为心肌细胞（Nk×2.5+细胞），心内膜和血管内皮细胞（Flk1+细胞）（-）。但是，大多数血管内皮细胞来源于静脉窦中已存在的内皮细胞（），仅有一部分在心肌壁内的细胞来源于心内膜细胞（）。在另一方面，前心外膜可分化为心外膜细胞，心脏成纤维细胞，部分血管内皮细胞及平滑肌细胞（93,94,-）。冠脉平滑肌细胞也可由心脏神经嵴处分化（）。因此，尽管发现严格意义上的干细胞确实鼓舞人心，但是并无确凿证据表明此类细胞存在于细胞转化中并对该过程有所贡献，比如HSCs相关过程。实际上，现阶段研究表明出生后的心脏细胞转化过程与其发育过程类似（表1）。例如，成纤维细胞和血管平滑肌细胞来源于心外膜（93,94），迁移到血管并增殖的内皮细胞产生了血管内皮细胞，前者来源于相邻内皮（-），亦可由骨髓来源的循环祖细胞或末梢血管内皮细胞（-），尽管人们尚不清楚循环祖细胞是否在损伤后分化为新生内皮细胞（-）。更重要的是，出生后的心肌细胞来源是已存在的心肌细胞群（58,,），心外膜细胞群[仅在胸腺肽β4预处理后表现（85）]及一些尚不明确的祖细胞群（44,62）。这些修复成年心脏的细胞系可能重新回到了发育初期，而且很少的细胞能克服不同细胞系之间的界限阻隔——这些都很引人深思。

必须指出的是：即使现阶段并无确凿证据显示“真正的”成年心脏干细胞在衰老及疾病过程中分化为其他细胞系，这并不意味着上述提及的细胞群没有治疗价值。另一方面，大量的证据显示，细胞疗法确实引起可观测到的成年心肌再生反应，而这种反应与他们是否具有分化能力无关。Lee实验室最近的研究可以作为一个很好的C-kit细胞再生作用例子：他们清晰地展示了在注射C-kit细胞后，新生心肌细胞的数量增多，细胞收缩功能提高，虽然在心脏中，C-kit细胞并不存在（）。

在本综述中，我们对证明缺氧信号在干细胞微环境中作用的相关文献进行了概括总结，这其中包括近期发现的心脏缺氧微环境。我们认为，研究者应该从细胞系分化潜能及缺氧信号如何调节细胞系功能两个方面入手，进一步研究心外膜缺氧微环境的特点——这也是调节心脏干细胞/祖细胞功能用以服务临床治疗的重要目标。

点击文末阅读原文，可阅读本篇全文。

《心血管领域新进展》为AME科研时间系列丛书的“小四”，本书12篇文章均精选自同行评审英文期刊CardiovascularDiagnosisandTherapy（简称CDT,《心血管诊断与治疗》），医院庄建院长、广东省心血管病研究所吴书林所长担任主编，来医院共20位译者共同完成。本书主要涵盖了心脏成像技术在心血管疾病诊断中的价值，陆续揭示了在探索心肺血管疾病发生发展过程中的最新发病机制。

超声心动图引导下的经皮诊断和治疗

经导管主动脉瓣移植（TAVI）的CT评估

年QCA、IVUS和OCT技术在介入心脏病学中的应用

左心室射血分数正常的低压差“严重”主动脉瓣狭窄

前瞻性心电触发冠状动脉CT血管成像：一种可有效替代冠状动脉造影的技术

心脏康复的过去、现在和未来

艾滋病患者的急性冠脉综合征：从病理生理到临床实践

心外膜和胸部脂肪的无创测量及临床意义

冠脉钙化积分研究——现状与展望

利用计算机断层扫描进行无创功能评价：何时才能实现临床应用？

心肌梗死后的左心室：利用心脏MRI预测疾病进程

冠脉解剖正常的心力衰竭患者：心脏MRI下不同病因的诊断算法与疾病表征